YANG Erwan, ZHANG Min, YANG Xingbin, et al. Tartary buckwheat tea polysaccharide induces mitochondria-mediated apoptosis in A549 human lung cancer cells[J]. Food Science, 2019, 40(13)： 110-115. (in Chinese with English abstract)DOI：10.7506/spkx1002-6630--093.

苦荞（Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn）种子经过筛选、烘烤等工序可制成苦荞茶，因其具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等众多生物学功能，被认为是一种“健康饮品”而备受欢迎[1-4]。苦荞茶多糖（tartary buckwheat tea polysaccharide，TBTP）是苦荞茶最主要的活性成分之一，本课题组利用水提醇沉法结合超声辅助技术，使TBTP提取率由3%提高至8%左右，为苦荞茶活性物质研究及应用、推广提供了一定的理论依据[5-6]。研究表明，苦荞多糖能够呈剂量依赖性地明显清除羟自由基，具有良好的抗氧化活性，使人肝癌细胞染色质DNA断裂、细胞核形态聚缩，抑制肝癌细胞增殖[7]。Wu等的研究发现荞麦多糖可诱导白血病细胞分化并抑制其增殖[8]。苦荞茶和苦荞在生物活性上有诸多相似之处，而前者作为一种更加便捷的食品，在生活中具有更好的推广和应用前景。然而，TBTP对肿瘤的影响及作用机制尚不清楚。因此，本研究以超声波辅助提取的TBTP为原材料，对人肺腺癌A549细胞进行处理，观察细胞增殖、凋亡情况以及氧化应激损伤指标，探讨TBTP对A549细胞凋亡的影响并探索其机制，以期为苦荞茶保健食品的开发及产品推广提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦荞茶购自四川西昌市滋元食品有限公司。TBTP采用超声波技术辅助水提醇沉获得，主要包括D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖等，其相对含量依次为4.47%、3.09%、8.55%、2.52%、6.28%、22.08%、12.49%、26.88%和13.64%[7]。A549细胞购自中国科学院细胞库。

RPMI-1640、胎牛血清 美国Hyclone公司；DHE上海碧云天生物技术有限公司；碘化丙啶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 美国Sigma公司；Mito SOX荧光染料 美国Thermo Fisher公司；Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、细胞色素c、剪切型半胱氨酸蛋白酶（caspase）-3、细胞色素c氧化酶IV（cytochrome c oxidase IV，COX IV）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶一抗 美国Abcam公司；线粒体分离试剂盒 美国Biovision公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司；倒置显微镜 日本Olympus公司；多功能酶标仪 德国BMG Labtech公司；GUAVA easy Cyte TM8HT流式细胞仪 美国Millipore公司；凝胶电泳系统、湿转系统、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；LSM800型激光扫描共聚焦显微镜 德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养及处理

A549细胞在含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640培养基、5% CO2、37 ℃条件下培养。当细胞生长至80%左右时，分为空白对照组和50、100、200、400、800 μg/mL TBTP处理组，进行相关指标的检测。

1.3.2 MTT 法检测细胞增殖

用上述不同质量浓度TBTP分别处理A549细胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT反应4 h，弃去培养液后加入150 μL二甲基亚砜，于37 ℃摇床充分振摇0.5 h，在多功能酶标仪490 nm波长处测定各处理组的OD值。细胞增殖率以各处理组与空白对照组OD值之比表示。

1.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

各组细胞处理结束后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 遍，使用100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC染液充分混匀，再加入5 μL碘化丙啶在室温、避光条件下染色15 min。染色结束后轻轻混匀细胞悬液，采用流式细胞术检测细胞凋亡变化。

细胞经Annexin V-FITC和PI双染之后，流式细胞图被分成4 个象限：第一象限为晚期凋亡细胞；第二象限为坏死细胞；第三象限为未发生凋亡的细胞；第四象限为早期凋亡细胞。细胞凋亡率＝晚期细胞凋亡率+早期细胞凋亡率，即第一和第四象限百分率之和。

1.3.4 细胞ROS水平检测

采用DHE染色法检测细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。接种于共聚焦培养皿中的A549细胞经TBTP处理结束后，使用0.5 μmol/L DHE染液在37 ℃孵箱中染色30 min，再用PBS清洗3 遍，加入1 mL完全培养基后在激光扫描共聚焦显微镜下采集荧光信号。DHE红色相对荧光强度增加表示ROS水平增加。

1.3.5 细胞线粒体ROS水平检测